小鼠胚胎成纖維細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒定教程

一：細(xì)胞簡(jiǎn)介

小鼠胚胎成年維細(xì)胞常用作ES細(xì)胞培養(yǎng)常用的飼養(yǎng)層細(xì)胞，能產(chǎn)生抑制ES細(xì)胞自主分化和促進(jìn)ES細(xì)胞增殖的因子，故能有效地促進(jìn)ES細(xì)胞的增殖井維持其示分化特性和多潛能性，

且分泌效果優(yōu)于外源添加的一些因子而且可以為ES細(xì)胞的培養(yǎng)提供類似于體內(nèi)的微環(huán)境故在研究哺彩L動(dòng)物ES細(xì)胞中得到廣泛使用。

二：實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

提前準(zhǔn)備好將要用到的工具、試劑：無(wú)菌槍頭、無(wú)菌EP管、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞專用培養(yǎng)基、胚胎成纖維細(xì)胞組織分離液、胚胎成纖維細(xì)胞

基礎(chǔ)培養(yǎng)基、HBSS緩沖液。

三：實(shí)驗(yàn)步驟

取孕13.5天小鼠,斷頸處死，置于體積分?jǐn)?shù)為75%酒精消毒3 min無(wú)菌打開孕鼠腹腔可見腹腔兩側(cè)呈“V"字型串珠樣子宮。用鑷子提起子宮（

注意:不能碰到皮毛，以防污雜）并用眼科剪去除子宮系膜和結(jié)締組織，將子宮放入含有HBSS的一次性無(wú)菌培養(yǎng)皿中漂洗兩三遍去除淤血，

用眼科剪和鑷子去除胎盤、手膜等胚胎外組織，取出胚胎放入另一平皿用HBSS洗滌，直到?jīng)]有血跡為止。用眼科剪和鑷子去除胚胎的頭部、

四肢及內(nèi)臟，留取軀干部（頭部、四肢及內(nèi)臟需去除干凈）將軀干部放入玻璃平皿中用HBSS洗滌1次，用眼科剪將胚胎軀干部剪碎成糊狀加入

5mL HBSS混勿移入離心管中，自然沉降3min后將上清液輕輕吸出棄掉加入3mL 組織分離液輕輕吹打后室溫下自然沉降2min，

將上清液輕輕吸出棄掉加入3mL 組織分離液輕輕吹打后室溫下消化3min，將上部的單細(xì)胞懸液輕輕吸出放入另一個(gè)離心管中加等量小鼠胚胎

成纖維細(xì)胞專用培養(yǎng)基終止消化，重復(fù)消化兩次若還有未消化的組織再加入2 mL組織分離液輕輕吹打至消化。終止消化，

混勻離心管收集所有細(xì)胞懸液自然沉降1min，將大塊沉淀吸出棄掉800轉(zhuǎn)每分鐘離心5mi棄去上清，

使用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞專用培養(yǎng)基重懸至5 mL吸取細(xì)胞溶液，加入臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)行計(jì)數(shù)按5x106/瓶接種到T25培養(yǎng)瓶中補(bǔ)足體積分?jǐn)?shù)為小鼠

胚胎成纖維細(xì)胞專用培養(yǎng)基記為原代（PO）搖晃混勻，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后換液。

細(xì)胞鑒定

24h后可見絕大部分貼壁細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣，細(xì)胞體積較小，雜細(xì)胞較少，30min細(xì)胞貼壁，其中部分開始伸出偽足，表現(xiàn)為小的突起，6h后細(xì)胞基本貼壁，伸展成梭形，胞核清晰，分布較均勻，散在生長(zhǎng)，不聚集成團(tuán)；分布較均勻，散在生長(zhǎng)，不聚集成團(tuán)，細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，

5-7天即呈融合狀態(tài)，細(xì)胞排列緊密，有的交叉重疊生長(zhǎng)，平坦、胞體較大，細(xì)胞質(zhì)透明，細(xì)胞核較大，呈橢圓形，顏色淡，細(xì)胞融合，

并彼此連接成網(wǎng)狀，細(xì)胞呈突起的紡錘形或星形的扁平分布。細(xì)胞呈突起的紡錘形或星形的扁平分布，細(xì)胞呈突起的紡錘形或星形的扁平分

布，小鼠胚胎成纖維細(xì)胞經(jīng)Vimentin免疫熒光鑒定純度可達(dá)90%以上