PCR的基礎(chǔ)原理

一章 PCR和RT-PCR基礎(chǔ)

PCR基礎(chǔ)

聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）過程利用模板變性，引物退火和引物延長的多個循環(huán)來擴增DNA序列。這是一個指數(shù)增長的過程，因為上一輪的擴增產(chǎn)物又作為下一輪擴增的模板，使其成為檢測核酸的一種非常靈敏的技術(shù)。一般，經(jīng)過20-30個循環(huán)得到的擴增產(chǎn)物就足夠在溴化乙錠染色的凝膠上觀察到。反應(yīng)包括幾個成分（表1）。模板可以為純化的基因組或質(zhì)粒DNA；由RNA轉(zhuǎn)化得到的cDNA；或未經(jīng)純化的粗制生物樣品，如細菌克隆或噬菌斑。引物確定了擴增產(chǎn)物的序列和長度。常用的熱穩(wěn)定聚合酶是Taq DNA聚合酶。這種酶適用于常規(guī)擴增，但是使用其他熱穩(wěn)定聚合酶會改善結(jié)果。擴增反應(yīng)還包括緩沖液，三磷酸脫氧核苷及鎂離子。鎂離子濃度影響酶的活性、引物退火、模板和PCR產(chǎn)物的熔點（Tm），忠實性以及引物二聚體的形成等。在隨后的章節(jié)中將討論這些成分、循環(huán)參數(shù)以及其他參與作用的因子相互間各種作用對于成功PCR的影響。

表1. 反應(yīng)成分

Component Final Concentration

Template 10^4-10^6 copies of DNA template

Primer 1 0.1-0.5µM

Primer 2 0.1-0.5µM

10X Reaction buffer 1X

Magnesium 1.0-3.0mM

dNTP mix 200 mM each dNTP

Thermostable DNA polymerase 1-4 units/100 ml reaction

RT-PCR基礎(chǔ)

RT-PCR將以RNA為模板的cDNA合成同PCR結(jié)合在一起，提供了一種分析基因表達的快速靈敏的方法。RT-PCR用于對表達信息進行檢測或定量。另外，這項技術(shù)還可以用來檢測基因表達差異或不必構(gòu)建cDNA文庫克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印跡、RNase保護分析、原位雜交及S1核酸酶分析在內(nèi)的RNA分析技術(shù)，更靈敏，更易于操作。 RT-PCR的模板可以為總RNA或poly(A)+選擇性RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可以使用逆轉(zhuǎn)錄酶，以隨機引物、oligo(dT)或基因特異性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在條件下進行。cDNA的合成首先在逆轉(zhuǎn)錄緩沖液中進行，然后取出1/10的反應(yīng)產(chǎn)物進行PCR。在一步法RT-PCR中，逆轉(zhuǎn)錄和PCR在同時為逆轉(zhuǎn)錄和PCR優(yōu)化的條件下，在一只管中順次進行。

PCR的基礎(chǔ)原理

圖1. RT-PCR概圖

這本指南闡述了成功RT-PCR和PCR的關(guān)鍵。高靈敏性（從小量樣品中得到足量結(jié)果）和高特異性（選擇性地僅得到所需的產(chǎn)物）是成功PCR的標志。可以通過仔細的實驗設(shè)計（如選擇恰當(dāng)?shù)拿?，設(shè)計理想的引物，使用不同的緩沖液和添加劑，確定循環(huán)參數(shù)及制備高質(zhì)量的模板等）以獲得的RT-PCR和PCR。

PCR的基礎(chǔ)原理