實(shí)驗(yàn)方法原理

細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)晚期，以培養(yǎng)基制備高濃度細(xì)胞懸液，加入細(xì)胞保護(hù)劑，等份轉(zhuǎn)移至凍存管中，緩慢冷凍。

細(xì)胞凍存時(shí)向培養(yǎng)基中加入保護(hù)劑，即終濃度5%.15%的甘油或二甲基亞砜（DMSO），可使溶液冰點(diǎn)降低，加之在緩慢凍結(jié)條件下，細(xì)胞內(nèi)水分透出，減少了冰晶形成，從而避免細(xì)胞損傷。 采用"慢凍快融"的方法能較好地保證細(xì)胞存活。標(biāo)準(zhǔn)冷凍速度開始為-1 到 -2℃/min，當(dāng)溫度低于-25℃時(shí)可加速，到-80℃之后可直接投入液氮內(nèi)（-196℃）。

實(shí)驗(yàn)材料

細(xì)胞

試劑、試劑盒

胰蛋白酶 BSS DMSO

儀器、耗材

吸管 離心管 玻璃安瓿 酒精燈 線繩 紗布口袋 搪瓷罐

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 肉眼及顯微鏡觀察，確保細(xì)胞滿足冷凍標(biāo)準(zhǔn)。

 2.使細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)晚期，若為貼壁細(xì)胞，用胰酶消化，并進(jìn)行細(xì)胞技數(shù)。若為懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并離心。

 3.懸浮細(xì)胞的濃度為：2×106個(gè)~2×107個(gè)細(xì)胞/ml。

 4.將以下任意一種細(xì)胞保護(hù)劑加入到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，配制凍存液：

（a） 加10%~20%的二甲基亞砜（DMSO）或（b）加20%~30%甘油。

 5. 用凍存液將細(xì)胞懸液按1：1的比例稀釋至細(xì)胞度濃約為1×106 ~1×107 /ml ,此時(shí)DMSO的濃度為5%-10%（或甘油濃度為10-15%）。建議勿將凍存管置于冰上，減少細(xì)胞退化。使用DMSO時(shí)，室溫操作30min是無害的，當(dāng)使用甘油時(shí)，則對(duì)細(xì)胞是有益的。

 6. 將細(xì)胞懸液分裝至預(yù)先標(biāo)記好的凍存管中，蓋上蓋子，擰緊，密封，注意不要太緊，避免螺旋扭曲變形。

 7. 將凍存管夾在鋁條上，裝入儲(chǔ)存筒中，或?qū)⑵渌缮⒌嘏帕性诔閷蟽?chǔ)存器中。

 8. 將凍存管通過上述方法之一以1℃/min的速率進(jìn)行冷凍。使用隔熱保溫的方法，使凍存管達(dá)到-70℃，若最初溫度為20℃，則需4~6h，但好于-70℃過夜。

 9.當(dāng)凍存管溫度達(dá)到-70℃或更低時(shí)，在將其從-70℃或能控制冷凍速率的冷凍柜中轉(zhuǎn)移出來之前，檢查冷凍記錄，確定液氮罐中存放凍存管的合適位置。

 10. 將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮冷凍罐中，好不要使其浸沒在液氮中，將放油凍存管的鋁條和紙質(zhì)管放入預(yù)先確定的儲(chǔ)存筒中，或?qū)€(gè)別凍存管放入預(yù)先確定的抽屜中。該步驟必須迅速（＜2min），因?yàn)閮龃婀軙?huì)以越10℃/min的速度升溫，如果溫度上升超過-50℃，細(xì)胞會(huì)迅速惡化。

注意事項(xiàng)

1.二甲基亞砜能穿透許多合成的或天然的膜，包括皮膚和橡膠手套 。因此，應(yīng)謹(jǐn)慎處理。

 2.將凍存管放入液氮時(shí)，必須使用保護(hù)性手套和面罩。

其他1.  為保持細(xì)胞最大存活率，一般都采用慢凍存融的方法。

2.  凍存物距液氮面越近溫度越低。標(biāo)準(zhǔn)的低凍速度為－1℃~12℃/分鐘，當(dāng)溫度下降達(dá)－25℃時(shí)，下降速度可增至－5~－10℃/分鐘，到－100℃時(shí)則可迅速凍入液氮中。因此要適當(dāng)掌握凍存物下降入液氮中的速度，過快能影響細(xì)胞內(nèi)水分透出，太慢則促冰晶形成。

3.  初次凍存者在下降凍存時(shí)，宜先用細(xì)木棒伸入罐中探測(cè)液面位置，然后需用溫度計(jì)與凍存物并行的辦法，以觀測(cè)下降凍存物的速度、凍存物與液氮液面距離和溫度三者關(guān)系，當(dāng)已掌握以上各參數(shù)和凍存技術(shù)熟練后，僅按下降時(shí)間和下降距離便可獲理想凍存效果。

4.  各種細(xì)胞對(duì)凍存速度的要求也不一樣；上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞耐受性可能大些，骨髓干細(xì)胞－2~－3℃/分鐘合適；胚胎細(xì)胞耐受性較小，不宜太快?？傊谝婚_始時(shí)，下降速度不能超過－10℃/分鐘。

5.  用什么防護(hù)劑合適和用量多大，要依細(xì)胞而定，初代培養(yǎng)細(xì)胞用DMSO 較好，一般細(xì)胞可用甘油；用量以較小為好。有人認(rèn)為人皮膚上皮細(xì)胞貯存在20%-30%甘油中很好。

6.  原則上細(xì)胞在液氮中可貯存多年，但為妥善起見，凍存一年后，應(yīng)再?gòu)?fù)蘇培養(yǎng)一次，然后再繼續(xù)凍存。