細(xì)胞老了怎么辦？體外細(xì)胞衰老全解析

體外細(xì)胞（細(xì)胞培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)室瓶 / 皿里的細(xì)胞）衰老，≠體內(nèi)人體衰老，是體外培養(yǎng)條件下細(xì)胞增殖能力逐步喪失、功能退化的現(xiàn)象，最典型就是 Hayflick 極限：正常二倍體細(xì)胞體外不能無(wú)限分裂，到達(dá)一定代次就停止增殖，進(jìn)入衰老狀態(tài)。

一、什么是體外細(xì)胞衰老

體外細(xì)胞衰老（復(fù)制性衰老）：正常體細(xì)胞每分裂一次，端?？s短一點(diǎn)；端粒縮短到臨界長(zhǎng)度，細(xì)胞就停止分裂，不再增殖，但細(xì)胞不會(huì)立刻死亡，依舊存活，形態(tài)、代謝發(fā)生明顯改變。

區(qū)分兩個(gè)概念

復(fù)制性衰老：傳代次數(shù)太多，端粒耗竭，生理性衰老（正常二倍體細(xì)胞，如人成纖維細(xì)胞）

應(yīng)激誘導(dǎo)早衰 (SIPS)：不是傳代多，外界刺激直接逼細(xì)胞變老：氧化損傷、血清太差、pH 失衡、胰酶過(guò)度消化、傳代密度不對(duì)、藥物毒性，實(shí)驗(yàn)室最常見。

癌細(xì)胞、永生化細(xì)胞系（HEK293、HeLa）有端粒酶，可以繞過(guò) Hayflick 極限，一般不會(huì)發(fā)生復(fù)制性衰老，但依然會(huì)出現(xiàn)應(yīng)激誘導(dǎo)早衰。

二、衰老體外細(xì)胞典型外觀 & 檢測(cè)信號(hào)

細(xì)胞形態(tài)肉眼觀察

細(xì)胞體積變大、扁平、鋪展很開，輪廓肥大

胞內(nèi)顆粒增多、空泡變多，折光差

增殖極慢，幾乎不匯合，倍增時(shí)間大幅拉長(zhǎng)

碎片增多，貼壁松散，不容易長(zhǎng)密

常用衰老檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

SA?β?gal β?半乳糖苷酶染色：zui經(jīng)典衰老染色，衰老細(xì)胞胞質(zhì)藍(lán)染；注意：pH 條件不對(duì)會(huì)假陽(yáng)性，死亡細(xì)胞也會(huì)染色，不能單靠這一個(gè)結(jié)果下定論。

分子標(biāo)記：p16INK4a 上調(diào)（應(yīng)激早衰核心）、p21 上調(diào)；端粒長(zhǎng)度檢測(cè)（復(fù)制性衰老端粒顯著縮短）

β?gal + 增殖標(biāo)記 Ki?67 共染：衰老細(xì)胞 Ki?67 陰性，停止增殖。

三、為什么你的培養(yǎng)細(xì)胞會(huì)提前變老（實(shí)驗(yàn)室常見誘因）

1. 傳代相關(guān)

1）傳代次數(shù)過(guò)高，接近 Hayflick 極限（原代 / 正常二倍體細(xì)胞）

2）傳代過(guò)?。航臃N密度太低，細(xì)胞被迫長(zhǎng)時(shí)間處于低密環(huán)境，極易觸發(fā) SIPS 早衰

3）胰酶消化過(guò)度，損傷細(xì)胞膜，DNA 損傷，誘導(dǎo)衰老

4）傳代不及時(shí)，細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間長(zhǎng)滿接觸抑制，持續(xù)壓迫，誘發(fā)早衰

2. 培養(yǎng)環(huán)境

血清品質(zhì)差、血清反復(fù)凍融、血清批次不穩(wěn)定；營(yíng)養(yǎng)匱乏

培養(yǎng)基久放，pH 偏酸 / 偏堿；谷氨酰胺降解產(chǎn)生氨毒性

孵箱不穩(wěn)定：溫度波動(dòng)、CO?濃度漂移；氧氣過(guò)高（大氣氧 21%，人體細(xì)胞體內(nèi)是 3?5% 氧，高氧造成氧化應(yīng)激，加速體外衰老）

反復(fù)凍融細(xì)胞，復(fù)蘇操作差，細(xì)胞 DNA 損傷積累

3. 污染與隱性脅迫

支原體隱性污染！很多人忽略，支原體不會(huì)渾濁，但持續(xù)造成 DNA 損傷，細(xì)胞快速衰老、長(zhǎng)不好。

四、細(xì)胞老了怎么辦？分情況處理

情況 1：原代 / 有限壽命二倍體細(xì)胞（如人皮膚成纖維細(xì)胞）已經(jīng)衰老

?沒有辦法 “逆轉(zhuǎn)已經(jīng)衰老的細(xì)胞"

已經(jīng)進(jìn)入衰老狀態(tài)的體外細(xì)胞：不要再挽救，直接丟棄。

不要試圖換液、加各種試劑讓老細(xì)胞重新增殖。衰老細(xì)胞是增殖永jiu阻滯，強(qiáng)行處理也只會(huì)殘留受損細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)wan全不可靠。

解決方案：復(fù)蘇低代次凍存種子細(xì)胞，用早期代次細(xì)胞重新做實(shí)驗(yàn)。

重點(diǎn)：正常體細(xì)胞一定要早凍！早代就備份種子，不要用到很高代。

情況 2：細(xì)胞還沒che底衰老，但出現(xiàn)早衰苗頭（長(zhǎng)得慢、變大，還沒有wan全阻滯）

優(yōu)先排查、消除誘因，阻止進(jìn)一步衰老：

核對(duì)傳代密度，禁止低密度接種，按照細(xì)胞說(shuō)明書推薦接種量；不要讓細(xì)胞過(guò)度長(zhǎng)滿

優(yōu)化消化時(shí)間，胰酶及時(shí)終止，不要過(guò)度消化

更換新鮮培養(yǎng)基，確認(rèn)血清質(zhì)量，培養(yǎng)基現(xiàn)配現(xiàn)用，避免氨積累

檢查孵箱 CO?、溫度；條件允許，原代體細(xì)胞用低氧培養(yǎng)（3?5% O?）降低氧化損傷

做支原體檢測(cè)，清除隱性污染

不要再繼續(xù)拔高傳代；盡快凍存種子。

情況 3：想要獲得永生化，繞開復(fù)制性衰老（科研工具）

僅科研體外實(shí)驗(yàn)，絕對(duì)不能用于人體

導(dǎo)入端粒酶 TERT：延長(zhǎng)端粒，實(shí)現(xiàn)永生化，保留細(xì)胞原有表型，是常用；

SV40 大 T 抗原、HPV E6/E7：抑癌基因 p53/Rb 滅活，實(shí)現(xiàn)永生化，但細(xì)胞表型會(huì)發(fā)生改變。

永生化不等于癌細(xì)胞，但是基因組穩(wěn)定性下降，實(shí)驗(yàn)依然需要驗(yàn)證表型。

五、實(shí)操總結(jié)（實(shí)驗(yàn)室速記）

有限壽命細(xì)胞：早傳、早凍存低代種子，不要硬拉高代次；

長(zhǎng)得慢、細(xì)胞肥大，先懷疑：支原體、接種密度、消化損傷、培養(yǎng)基老化；

wan全衰老細(xì)胞直接舍棄，不要搶救；

要研究衰老模型：兩種造模

復(fù)制衰老：持續(xù)傳代直到 Hayflick 極限；

應(yīng)激早衰 SIPS：H?O?氧化處理、藥物 DNA 損傷誘導(dǎo)快速造模。