方法概述

小鼠骨髓中性粒細(xì)胞分離常用的是密度梯度離心法（Percoll 或 Histopaque 梯度）?。骨髓是比外周血、腹腔更便捷且數(shù)量更充足的中性粒細(xì)胞來源。與免疫磁珠分選相比，密度梯度法更快速、經(jīng)濟(jì)，且可避免抗體標(biāo)記引起的中性粒細(xì)胞激活。

基本步驟（密度梯度離心法）?

1骨髓單細(xì)胞懸液制備：處死小鼠（常用8-12周齡C57小鼠），無菌提取股骨和脛骨，剪去兩端軟骨露出骨髓腔，用1mL無菌注射器吸取含10%胎牛血清的稀釋液/PBS沖洗骨髓腔，制備成2×10?-1×10?/ml的骨髓單細(xì)胞懸液。

2梯度離心：可采用 Histopaque-1077 + Histopaque-1119 雙層梯度，或 Percoll（如55%、65%、75%）梯度。雙梯度法較常用：先在離心管加入試劑A（如1119）下層，再疊加試劑C（如1077）形成梯度界面，將細(xì)胞懸液平鋪其上。

3離心：室溫、水平轉(zhuǎn)子，離心力與時(shí)間視體系而定——反饋資料中常用800g離心30min，試劑盒說明建議500-1000g離心20-30min（最大不超過1200g）。

4收集細(xì)胞層：離心后出現(xiàn)兩層環(huán)狀乳白色細(xì)胞層，上層為單個(gè)核細(xì)胞，下層（試劑C與試劑A之間及試劑A中）為中性粒細(xì)胞層，小心吸取。

5洗滌/裂紅：如混有紅細(xì)胞可加入紅細(xì)胞裂解液；用PBS或洗滌液250g離心10min洗滌。

6重懸計(jì)數(shù)：重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)備用。

純度與活力

基于密度梯度離心的方案通?？色@得高純度（80-95%）且高活力（>95%）? 的中性粒細(xì)胞。不過有實(shí)驗(yàn)者反饋，實(shí)際操作中單只小鼠獲量可能少于1×10?、純度約80%，與文獻(xiàn)報(bào)道（總量約6×10?、純度95%以上）存在差距。

鑒定與質(zhì)控

分離后的中性粒細(xì)胞可通過表面標(biāo)志物L(fēng)y6G（免疫熒光法/流式檢測(cè)）進(jìn)行鑒定，也可經(jīng)PMA刺激后檢測(cè)髓過氧化物酶（MPO）釋放來驗(yàn)證功能活性。

注意事項(xiàng)（要點(diǎn)）?

全程嚴(yán)格無菌操作。

分離液與樣本需平衡至室溫（18-25℃）；低溫離心可能加重紅細(xì)胞污染。

稀釋/洗滌細(xì)胞時(shí)不可使用含Ca、Mg離子的緩沖液，否則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凝集、降低得率與純度。

若需進(jìn)一步培養(yǎng)，注意無菌操作避免污染。

離心轉(zhuǎn)速大小、時(shí)間長(zhǎng)短、細(xì)胞密度都會(huì)影響分層效果（目的細(xì)胞殘留血漿層往往是轉(zhuǎn)速過小/時(shí)間過短；殘留在分離液內(nèi)往往是轉(zhuǎn)速過大/時(shí)間過長(zhǎng)），需按實(shí)驗(yàn)條件摸索優(yōu)化。

其他方法

除密度梯度法外，還可采用正向免疫磁珠選擇或流式分選（FACS）? 直接從組織分離高純度中性粒細(xì)胞；對(duì)于JI高純度需求，密度梯度分離后也可配合免疫磁珠分選進(jìn)一步純化